LuSens Test - eine in vitro Zellkulturmethode

Luciferase-gekoppeltes Messsystem zur Untersuchung des hautsensibilisierenden Potentials von Substanzen

LuSens, OECD testguideline no. 442D, Hautsensibilisierung, in vitro

Das Video zeigt die experimentelle Durchführung des Zell-basierten LuSens Tests.

Der LuSens Test ist eine akzeptierte Alternativmethode zum Tierversuch, um zu prüfen, ob eine Substanz Hautallergien auslösen kann. Die Allergieentstehung wird Hautsensibilisierung genannt. Sie beginnt mit der Bindung der Substanz an ein Hautprotein, gefolgt von der Aktivierung dendritischer Zellen (Immunzellen) und der Stressantwort der Hautzelle. Der LuSens Test zeigt diesen Stress in Hautzellen an. Er wird in Kombination mit zwei weiteren in vitro Methoden eingesetzt, die die beiden anderen Ereignisse prüfen. Zusammen ersetzen die Methoden den gängigen Tierversuch, den lokalen Lymphknotentest in der Maus. Der LuSens Test sagt in Kombination mit den anderen Methoden die hautsensibilisierende Wirkung einer Substanz beim Menschen zuverlässiger voraus als der Tierversuch an der Maus (wie in der Literatur beschrieben, Urbisch et al., 2015).

Der LuSens Test ist eine in vitro Methode, bei der genetisch modifizierte Hautzellen (Keratinozyten) einsetzt werden, um Substanzen zu identifizieren, die in Keratinozyten Stressreaktionen verursachen können (LuSens, Bauch et al., 2012, Ramirez et al., 2014 und Ramirez et al., 2016 ). LuSens Zellen enthalten ein Luziferase-Reportergen unter Kontrolle des „antioxidant response element“ (ARE). Im Assay wird die vermehrte Expression des Reportergens nach 48-stündiger Inkubation mit Prüfsubstanzen gemessen. Eine erhöhte Luziferase-Aktivität zeigt ein Stresssignal über die Aktivierung des Keap1-Nrf2 Signaltransduktionsweges an, die zu einer hautsensibilisierenden Wirkung führen kann.

Der LuSens Test wird in 96-Wellplatten durchgeführt. Mehrere Prüfsubstanz-konzentrationen, sowie zugehörige Kontrollen, werden parallel getestet. Die Luziferase-Aktivität wird über durch die Oxidation des Luziferinsubstrates emittierte Licht bestimmt (Biolumineszenz-Messung). Parallel wird ein Zelltoxizitätstest (MTT-Test) durchgeführt, um die relative Zellvitalität zu bestimmen. Der Zytotoxizitätstest misst die Abnahme lebender Zellen, die das Substrat 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu einem purpurnen Formazan umsetzen können (photometrisch).

Wegen der Komplexität des Hautsensibilisierungs-Prozesses ist ein einzelner in vitro Test nicht ausreichend um diesen toxikologischen Endpunkt zu bestimmen. Daher werden verschiedenen Methoden in einer integrierten Teststrategie kombiniert. Die einzelnen Methoden bilden Schlüsselereignissen der Hautsensibilisierung ab: Veränderung der Hautproteine (bspw. durch kovalente Bindung der Testsubstanz), Entzündungsreaktion der Keratinozyten (ausgelöst durch Stresssignale, die der LuSens Assay misst) sowie die Aktivierung von dendritischen Zellen (Bauch et al., 2012, Urbisch et al., 2015).

forum login